miércoles, 7 de mayo de 2014

Química everywhere: Mis primeros western blots

El western blot es una técnica que se usa para detectar y cuantificar proteínas mediante una electroforesis en gel; la transferencia del gel a una membrana adsorbente y el revelado de la membrana mediante anticuerpos. Tal como se lee en la Wikipedia su nombre viene por alusión a otra técnica, el Southern blot, que a su vez tomaba el nombre de su descubridor (E. Southern).

La verdad es que, después de esta entrada completa y detallada sobre la técnica del western blot en Scykness, poco queda por decir, y sin embargo no me resisto a aportar mi granito de arena. He hecho mis primeros western (los de la carrera, si los hice, no cuentan :P), y supongo que un químico se enfrenta de distinta manera y se fija en cosas distintas a las de un biólogo o bioquímico. Que nadie se ofenda, y sentiros muy libres de corregir :)

Así que aunque existen muchas maneras y tipos de hacer cada uno de los pasos de que consta la técnica de western blot, me voy a centrar exclusivamente en los pasos que seguimos para cuantificar la enzima alfa-galactosidasa o GLA (que se usa para el tratamiento de la enfermedad de Fabry). Es decir, solo queríamos cuantificar una única proteína, por un método ya establecido y usado varias veces.


Pero vayamos poco a poco… ¿A qué nos referimos con la palabra “gel”? En la mayoría de los casos se trata de un polímero en forma de red que nos sirve para “cargar” nuestras proteínas y separarlas. En este caso los geles usados eran de acrilamida junto al agente reticulante, de manera que finalmente obtenemos una “red” de poliacrilamida. Como queremos que toda la muestra empiece el recorrido a la vez, podemos usar un gel que tenga dos partes diferenciadas: el stacking y el running. En realidad solo se distinguen por la concentración en acrilamida. En el stacking tenemos los pocillos en los que cargamos la muestra, y cuando llega a la frontera con el running se paran hasta que apliquemos la corriente eléctrica. Tal como explica Óscar en el comentario abajo: El stacking gel tiene menos concentración de acrilamida/bisacrilamida para dejas pasar fácilmente todas las proteínas. Cuando llegan al Separating o running gel, se apelotonan y comienzan a migrar mas despacio, pero entran casi todas a la vez. Tanto para que pasen el stacking como para el separating se requiere corriente. No llegan solas al running gel. Incluyo las correcciones de Óscar en color azul.


Lo que parecen almenas representan los pocillos del stacking. Separating gel equivaldría a lo que llamamos running
Antes de cargar la muestra, la mezclamos con el tampón de carga, que básicamente contiene SDS y urea (desnaturalizan la proteína presente y la dejan lista y preparada para la electroforesis en gel. En este caso se pone SDS, un detergente, porque se trata de un gel desnaturalizante. Se pone por tanto no solo en la muestra sino también en el propio gel. Pero existe otra forma de hacer los geles de forma nativa. No se añade sds y los marcadores son distintos porque no solo migran por tamaño sino por Punto isoeléctrico.) y el glicerol, que es un muy importante… Porque los geles se colocan en vertical en una cubeta llena de líquido (el tampón de electroforesis)… Los pocillos son muy pequeños y has de cargarlos en el interior del tampón con una punta de micropipeta. El glicerol es una molécula “pesada”El glicerol no es mas pesado, es mas denso y arrastra la muestra al fondo del pocillo. que hace que nuestra muestra no se escape del pocillo hacia arriba sino que caiga dentro y siga su recorrido por el stacking.
Cargando la muestra en los pocillos. El color azul ayuda a ver cómo hemos cargado el pocillo El colorante azul nos ayuda a ver como hemos cargado el pocillo y por donde va la migración... pero no solo eso. Es un indicador de pH. Si se pone amarillo, nuestras proteínas migrarán en sentido contrario, es decir, se saldrán por arriba. En ese caso debemos neutralizar con hidróxido sódico o algo parecido el pH de la muestra hasta volverla de nuevo azul.

Una vez tenemos listos nuestros geles con la muestra dentro de la cubeta, conectamos los electrodos y aplicamos una determinada corriente eléctrica durante el tiempo necesario para separar las proteínas. ¡Un momento! ¿Cómo vemos que está pasando lo que tiene que pasar? En cada gel no solo se carga la muestra, sino también una recta patrón y lo que se llama el marcador molecular. El marcador contiene muchas proteínas con una tinción visible, las proteínas del marcador al separarse en el gel, nos permiten ver que todo está saliendo bien. Hasta que no revelemos nuestra muestra con anticuerpos, no podremos ver dónde ha quedado nuestra proteína en el gel.
Aquí puedes ver la colocación en la cubeta para hacer la electroforesis


Pero antes de revelar, necesitamos transferir nuestro gel a una membrana absorbente, que está hecha ¡de nitrocelulosa! La nitrocelulosa, o nitrato de celulosa o celuloide puede formar una base transparente que se emplea en las emulsiones de las películas fotográficas. En el caso de un western blot interesa que las bandas del gel (la mayoría invisibles todavía para nosotros) se transfieran a la membrana. ¿Cómo? Introduciendo los geles y las membranas en un sistema “sandwich” (una vez más, lo tienes explicado en más detalle en Scykness) y otra vez en la cubeta con un buffer o tampón de transferencia. Aplicando electricidad, conseguiremos transferir las bandas del gel a la membrana: todo listo para empezar a trabajar con los anticuerpos.

Los anticuerpos son moléculas que reaccionan muy específicamente a su antígeno, en este caso, hemos seleccionado un anticuerpo de conejo anti-GLA; es decir, que su antígeno es la GLA, por lo que podemos esperar que se una selectivamente a la proteína de nuestras muestras. Pero además vamos a ayudarlo: porque si la membrana de nitrocelulosa es buena como para que se “peguen” las proteínas desde el gel, también lo será para que reaccione con el anticuerpo primario y eso no nos interesa…Empezamos con el paso de bloqueo, que consiste únicamente en introducir nuestra membrana en leche, que tiene montones de proteínas que se unirán a la membrana, inactivando todos los sitios a los que podría unirse el anticuerpo. Así nos aseguramos de que el anticuerpo se una casi exclusivamente a la GLA.



Pero seguimos sin ver nuestras bandas… Necesitamos el anticuerpo secundario: un anticuerpo de anti-conejo (para que se pegue al anticuerpo primario) y que además contiene la enzima peroxidasa. Ahora solo falta añadir los reactivos para que se produzca la reacción quimioluminiscente: el luminol y el peróxido de hidrógeno (o agua oxigenada). La enzima peroxidasa en presencia de agua oxigenada cataliza la oxidación del luminol. ¿Te suena? Efectivamente: es la reacción preferida de CSI.


Finalmente, con el programa Quantity One podemos sacar fotos de nuestra membrana de nitrocelulosa revelada a base de anticuerpos, y hacer una densitometría de las bandas de proteína. El programa integra el área de la banda, haciendo el sumatorio de la intensidad de cada pixel.

Y así, amigos y amigas, podemos saber cuánta GLA hemos encapsulado haciendo ciencia básica, que con un poquito de suerte y un muchito de trabajo, queremos conseguir que llegue a ser un tratamiento para la enfermedad de Fabry. ¿Por qué me he empeñado en daros la brasa con el western blot? Porque me resultó muy intrigante encontrar membranas de nada menos que celuloide seguidas por el luminol, que me trajo a la memoria el XXIV Carnaval de Química, y si no leed lo que en su momento escribió @cuantozombi:

La química, la música y el cine. 
La temática de los artículos que participan en el carnaval es libre, pero es vuestra oportunidad de demostrar la influencia de la química en el cine y en la música. No solo en el contenido de películas, productos televisivos o álbumes musicales, sino también en la tecnología usada. Como la semana me ha dejado corto de imaginación, os pongo algunos ejemplos cercanos:·         Roskiencia, el mayor exponente de la cantera de la divulgación, nos habló hace poco del luminol, la herramienta favorita de la legión de CSIs que llena nuestras pantallas.·         Ununcuadio nos habló de la química del cine y su volatilidad.·         Y no podía dejar fuera al organizador del primer carnaval, no es una historia nueva, pero hace poco alguien la sacó del baúl de los recuerdos: ¿Por qué el Dr. Manhattan eligió a Bohr? Aunque ya se que Watchmen es un comic –y qué comic–, también es película y no hay que ser muy estricto.
Por eso: la próxima vez que hagas un western blot, sonríe y piensa en cine (en La invención de Hugo o Malditos bastardos aparece el celuloide), o bien en tus series favoritas de CSI o ya asociándolo a @cuantozombi en The Walking Dead xDD


Este post participa en la Edición XXXV (Edición del Br) del  Carnaval de Química, cuyo anfitrión es Ángel Rodríguez (@1797Angel) en su blog CIENCIA PARA TODOS y en la XXX Edición del Carnaval de Biología que acoge Activa tu Neurona


Para saber más:

Sobre el celuloide: lo más completo y divulgativo lo encontrarás en ISQCH.

Sobre los western blot: una vez más te enlazo la estupenda entrada de Scykness. Por si quieres algo más técnico, relacionado con la cuantificación de GLA, puedes consultar este artículo: Corchero, J., Mendoza, R., Ferrer-Miralles, N., Montràs, A., Martínez, L., & Villaverde, A. (2012). Enzymatic characterization of highly stable human alpha-galactosidase A displayed on magnetic particles Biochemical Engineering Journal, 67, 20-27 DOI: 10.1016/j.bej.2012.05.003


También he consultado las entradas en inglés de la Wikipedia: Western blot y gel electrophoresis, de donde he sacado la mayoría de las imágenes para este post.

2 comentarios:

  1. Muy buenas Uuq, veo que te has lanzado al bonito mundo de la biología molecular... pobre, ¿No tenías otra cosa que hacer? jajajaja.

    Si me lo permites te voy a hacer un par de apuntes que no se si no lo has explicado bien o es que no lo has entendido del todo.

    El stacking gel tiene menos concentración de acrilamida/bisacrilamida para dejas pasar fácilmente todas las proteínas. Cuando llegan al Separating o running gel, se apelotonan y comienzan a migrar mas despacio, pero entran casi todas a la vez. Tanto para que pasen el stacking como para el separating se requiere corriente. No llegan solas al running gel.

    El glicerol, como sabrás, no es mas pesado, es mas denso y arrastra la muestra al fondo del pocillo.

    El colorante azul nos ayuda a ver como hemos cargado el pocillo y por donde va la migración... pero no solo eso. Es un indicador de pH. Si se pone amarillo, nuestras proteínas migrarán en sentido contrario, es decir, se saldrán por arriba. En ese caso debemos neutralizar con hidróxido sódico o algo parecido el pH de la muestra hasta volverla de nuevo azul.

    En este caso se pone SDS, un detergente, porque se trata de un gel desnaturalizante. Se pone por tanto no solo en la muestra sino también en el propio gel. Pero existe otra forma de hacer los geles de forma nativa. No se añade sds y los marcadores son distintos porque no solo migran por tamaño sino por Punto isoeléctrico.

    Por último, y esto ya es mas curiosidad que otra cosa, ya existen anticuerpos monoclonales primarios que vienen marcados con peroxidasa o cualquier otra enzima para ver las bandas. Suelen ser sobretodo anticuerpos para cosas muy comunes (como colas de histidina, que suele ser una forma muy común de purificar proteínas con columnas de Niquel)

    Sorry, espero que no te molesten las puntualizaciones porque por lo demás me ha parecido un muy buena entrada.

    Un abrazo

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    1. Un millón de gracias!! Efectivamente son cosas que no me habían quedado claras... Algunas no me las explicaron y otras probablemente las olvidé. He incluido tus correcciones a lo largo del texto en azul, ¡muchas gracias!

      No sabía lo de los anticuerpos primarios marcados, me ha sorprendido mucho... La verdad es que nunca he entendido por qué no se tenían que usar dos tipos de anticuerpos. Siempre me ha resultado una técnica complicada porque tengo la sensación de que se da un millón de vueltas hasta conseguir el resultado, jeje :P Yo tampoco sé cómo he llegado a la biología molecular ;P supongo que porque hacemos drug delivery y al trabajar con proteínas..., nos interesa saber cuánto encapsulamos. De momento, los western blots los hace otro grupo con el que colaboramos, pero queremos ir aprendiendo y nos tocó a una compañera y a mí visitar e intentar aprender.

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